一氧化氮对大鼠心脏骤停复苏后脑组织作用研究

[摘要] 目的 探讨一氧化氮（NO）对大鼠心脏骤停（SCA）复苏后脑组织的损伤作用。 方法 90只SD大鼠（雌雄不限）随机分为3组：假手术（A）组、NS对照（B）组、iNOS抑制剂干预（C）组，每组均分为6、12、24、48、72 h时间点，每时间点6只；除A组外，B、C组均于复苏即刻给药。制作窒息致大鼠SCA模型，自主循环恢复（ROSC）后各时间点取脑组织检测NO及脑组织含水量。 结果 （1）脑组织NO含量：A组各时间点之间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；B、C组与A组比较浓度明显增加，差异具有统计学意义（P < 0.01）；C组较B组各时间点比较结果降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。（2）脑组织含水量：A组各时间点之间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；B、C组与A组比较含水量明显增加，差异具有统计学意义（P < 0.01）；C组较B组各时间点比较差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 窒息致大鼠SCA复苏成功6 h后脑组织NO含量上升，24 h达高峰，与脑水肿程度基本一致，给予诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）抑制剂能抑制大鼠脑组织NO表达，减轻脑水肿，说明病理条件下产生的NO对复苏后脑组织起损伤作用。

[关键词] 一氧化氮；心脏骤停；脑水肿；实验研究

[中图分类号] R541.7+8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）02（c）-0005-03

Nitric oxide on rats brain tissue after cardiopulmonary resuscitation

TAN WeihuaZHOU YuanGUO WenlongNIE WeiJIANG Qixin QING Chen

ICU of The First Hospital of Hunan Traditional Chinese Medical College in Hunan Province, Zhuzhou412000, China

[Abstract] Objective To investigate effect of the nitric oxide on brain tissue after cardiac arrest (SCA) of the rats. Methods Ninty SD rats were divided into three groups without sex consideration: sham operation group (group A), NS control group (group B), and iNOS inhibitor intervention group (group C), and according to 6, 12, 24, 48, 72 h time point, each group were divided into five subgroups with 6 rats in each time point; group A were only given organ intubation and femoral vein catheter, group B and group C were made to cardiac arrest or asphyxia cardiac arrest model on the basis of group A, group C were given rapid intravenous injection of iNOS immediately after resusciation with on repetition later in order to build SCA model induced by asphyxia, and rats were sacrificed to detected brain water content as well as the expression of NO in rat brain. Results (1) NO content of brain tissue: Group A had a lower expression than group B and C with significant difference(P < 0.01), there was no significant difference at different time points in group A (P > 0.05 ); positive cells decreased in group C than group B at each time point with significant difference (P < 0.05). (2) Water content of brain tissue: Group A were significantly different (P < 0.01) with group B and C, there was no significant diffevence at different time points in group A (P ＞ 0.05), and significantly different (P < 0.05) were also found between group C and group B at each corresponding time. Conclusion NO expression in rat brain raises after CPR 6 h, and 24 h reaches the highest as well as hydrocephalus. The iNOS inhibitor can decrease the concentration of NO, reduce the hydrocephalus. So we can conclude that in the pathological condition produced NO is harmful on the rat brain after cardiopulmonary resuscitation (CPR).

[Key words] Nitric oxide; Cardiac arrest; Cerebral edema; Experiment research

心脏骤停是急危重的临床事件，抢救必须争分夺秒，尽管2010国际复苏指南颁布以来，心肺复苏（CPR）成功率逐渐提高，但患者的生活质量及出院率并未得到改善。研究[1]发现在CPR成功恢复自主循环的患者中仅有少数能达到神经功能一定程度的恢复，心脏骤停（SCA）后脑损伤是CPR后神经细胞的缺血缺氧性损害，神经细胞一旦受损，其导致的神经功能障碍严重影响患者的生活质量及其预后，因此脑复苏是临床医师研究的重点及难点。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组

6～8周龄健康雄性SD大鼠（南昌大学医学院动物科学部提供）90只，体重230～280 g。按随机数字表法随机分成假手术（A）组、NS对照（B）组、iNOS抑制剂干预（C）组，每组分为6个时间点，每时间点6只，分别为6、12、24、48、72 h时间点；于各点断头取脑组织行NO及脑组织含水量检测。A组仅给予股动静脉置管及气管插管，B、C组行股动静脉置管及气管插管后制作窒息致SCA模型；B组注入C组同等剂量的0.9%氯化钠溶液予以对照；C组在复苏后即刻给予以iNOS抑制剂0.2 mg/kg剂量静脉快速注入。

1.2 动物模型的制作

采用气管夹闭窒息法来建立SCA模型。常规气管切开插管及动静脉置管，在动物HR、BP及R稳定后，夹闭气管插管导管端8 min，致动物窒息而使其出现心跳、呼吸停止，心电监护示收缩压 ≤ 25 mm Hg，心率呈直线，或心电图示心室纤颤、停止或电机械分离；后开放气道，频率为200次/min，呼吸机辅助通气（100%纯氧)，通气频率90次/min，潮气量6 mL/kg，同时进行人工胸外按压，按压深度为大鼠胸廓前后径的1/3，助手快速静脉推注肾上腺素20 μg/kg（必要时追加同等剂量）。所有实验参数设计和记录均参照实验研究的Utstein模式[2]。

1.3 脑组织NO含量测定

各时间点取脑组织，使用NS制备成10%脑组织匀浆，室温静置10 min后于2 000 r/min离心10 min，再取上清液0.5 mL。采用硝酸还原酶法脑匀浆NO测定。

1.4 脑组织含水量测定

各时间点取脑组织后风干，天平称重，然后放入80℃恒温电烤箱中烤24 h，烤至恒重后，再称重计算脑组织含水量，计算公式：脑组织含水量＝（脑湿重－脑干重）/ 脑湿重×100％。

1.5 统计学方法

所有数据用SPSS 13.0软件进行分析，计量资料结果以（x±s）表示，若方差不齐，采用秩转换的非参数Kruskal-Wallis H检验。计量资料若方差齐同，多样本间均数多重比较用SNK-q检验；均以P < 0.01为差异有高度统计学意义，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织NO的表达

与A组比各组脑组织NO浓度明显升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；而B、C组相应时间点相比差异均有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。见表1。

2.2 脑组织含水量

与A组比B、C组脑组织含水量明显增多，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与B组比，C组脑组织含水量差异具有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

3 讨论

1987年，研究[3]确认NO即为内源性内皮舒张因子，是一种结构简单的小分子气体，具有脂溶性和水溶性，水中溶解度为1 mmol/L，极易透过细胞膜，可在细胞内、外自由扩散，因其带有不成对电子而具自由基结构，是一种重要的神经递质；其易被氧化，很不稳定，半衰期仅为5～30 s。动物实验表明NO对缺血性脑损伤具有一定的保护作用，可调节脑血管张力[4]、抑制白细胞及血小板聚集黏附[5]、阻断NMDA受体、抑制NMDA受体介导的神经毒素作用[6]、减少内皮素的生成[7]、减少神经元凋亡[8]等；但过量的NO又具有伤害作用，这取决于NO产生的部位、时间、浓度和催化NO合成的酶系。目前已证实有3种NOS同工酶，即nNOS、eNOS和iNOS[9]。张劲松等[10]动物实验证实，缺血再灌注后，大鼠脑损伤侧脑室中eNOS活性下降，而NO和iNOS含量上升，提示脑缺血后脑组织iNOS可介导产生过量的NO；Wang P等[11]研究表明，脑损伤后iNOS被激活，能在短时间内生成高于正常时上千倍的NO。nNOS、eNOS二者合称为cNOS，在生理条件下即有表达，活性是短暂的，产生适量NO而调节正常生理功能[12]。NO在缺血缺氧中起着极其重要的损伤作用，其主要损伤作用机制可能为：（1）加重脑水肿。脑损伤后NO含量剧增，导致脑血管内皮细胞受损，血脑屏障受到破坏，组织间隙液体增加；同时可导致脑血管的调节功能障碍，减缓水肿液的消退；颅脑损伤时，NO亦可损害线粒体，使ATP产生不足，碍致使Na+-K+-ATP酶活性降低，通过Na+、K+交换，K+逸出细胞外，Na+在细胞内积聚，从而产生细胞内水肿[13]；（2）自由基作用[14]。NO具有不同的还原状态，即NO+、NO-、NO，过量的NO与体内超氧阴离子形成过氧亚硝基阴离子（ONOO-），其中以ONOO-的损伤作用最为严重，其本身亦是一种自由基，可引起广泛的脂质过氧化和蛋白酪氨基反应；（3）抑制细胞呼吸[15]；（4）破坏DNA[16]；（5）介导兴奋性氨基酸（EAA）对神经元的毒性作用，徐超等[17]认为NOS抑制剂对脑损伤的主要作用是促进抑制性氨基酸的释放。

本研究发现，窒息致大鼠SCA复苏成功6 h后脑组织NO含量上升，24 h达高峰，与脑水肿程度一致，给予诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）抑制剂能抑制大鼠脑组织NO表达，减轻脑水肿，说明病理条件下产生的NO对脑组织起损伤作用。

[参考文献]

[1] Cooper S，Cade J. Predicting survival，inhospital cardiac arrest：Resuseitation survival variables and training effectiveness[J]. Resuseitation，1997，35（1）：2-17.

[2] 陈尔真，蒋健. 复苏实验研究Utstein模式[J]. 中国急救医学，1999，19（2）：70-73.

[3] Palmer RM，Ferrige AG，Moncada S. Nirtic oxide erlease accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor[J]. Nature，1987，327（6122）：524-526.

[4] 孙长凯，黄远桂，李广德，等. 一氧化氮、一氧化氮合酶及其医学意义[J]. 解放军医学杂志，1995，20（1）：390-393.

[5] Faraci FM，Brain JE. Nitric oxide and the cerebral circulation[J]. Stroke，1994，25（3）：692-703.

[6] Lipton SA，Choi YB，Pan ZH，et al. Aredox-based mechanism for the neuroprotective and neurodestructive effects of nitric oxide and related nitrosocompounds[J]. Nature，2003，364（3）： 626-631.

[7] Spatz M，Stanimirovic D，Strasser A，et al. Nitro-L-arginine augments thendothelin-1 content of cerebrospinal fluid induced by cerebral ischemia[J]. Brain Res，1995，684（1）：99-102.

[8] Kluck RM，Bossy Wetzel E，Green DR，et al. The release of cytochrome c from mitochondria：a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis[J]. Science，2007，275（2）：1132-1136.

[9] Sessa WC. The nitric oxide synthase family of proteins[J]. J Vasc Res，1994，31（3）：131-143.

[10] 张劲松，何斌，邵斌霞，等. 神经节苷脂对大鼠脑缺血/再灌注后一氧化氮合酶的影响及机制[J]. 中国急救医学，2007，27（11）：1009-1012.

[11] Wang P，Ba ZF，Chaudry IH. Endothelial cell dysfunetion occurs very early following tranma-hemorrhage and Persists despite fluid resuscitation[J]. Am J Physiol，2003，93（11）：973-979.

[12] Xuna YT，Tang XL，Qiu Y，et al. Biphasic response of cardiac NO synthase isoforms to ischemic precondition in conscious rabbits[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000，279（5）：H2360-2371.

[13] Schote CP，Koster J，Veldhuis W，et al. Neuroprotection by selective nitric oxide synthase inhibition at 24 hours after perinatalhypoxia-ischemia[J]. Stroke，2002，33（12）：2304-2310.

[14] Beckman JS，Ye YZ，Chen J，et al. The interactions of nitric oxide with oxygeadicals and seavengers in cerebral ischemic injury[J]. Adv Neurol，2006，71（9）：339-354.

[15] Murakami A，Ohigashi H. Targeting NOX， INOS and COX-2 in inflammatory cells：chemoprevention using food phytochemicals[J]. Int J Cancer，2007，121（11）：2357-236.

[16] Bolanos JP，Almeida A，Medina JM. Nitric oxide mediates brain mitochondrial damage during perinatal anoxia[J]. Brain Res，1998，781（1）：117-122.

[17] 徐超，张绍东，崔雯，等. 一氧化氮合酶抑制剂（L-NNA）对缺血纹体兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸释放的影响[J]. 中国神经外科杂志，1998，14（4）：226-229.

（收稿日期：2011-12-14）