大肠埃希菌临床分离菌株喹诺酮类抗生素耐药机制研究

[摘要] 目的 探讨我院临床分离的大肠埃希菌株耐药基因的分布及其在耐药中的作用机制。 方法 选择我院临床分离的大肠埃希菌菌株，采用纸片扩散法进行喹诺酮类药物药敏试验，筛选耐药菌株并测定环丙沙星MIC，对喹诺酮耐药菌株进行qA、qB、aac-（6’）-Ib-cr、GyrA及ParC检测，并进行基因扩增测序。 结果 84株临床分离的大肠埃希菌菌株中有24株对喹诺酮类药物耐药，耐药率为28.4%。其中对2种药物耐药4株，对3种药物耐药6株，对5种药物耐药14株。耐药菌株MIC值为对照菌株148～596倍，24株耐药菌中检出qA质粒基因12株、qB质粒基因4株、aac-（6’）-Ib-cr基因4株、GyrA基因喹诺酮决定区突变11株、ParC基因决定区突变4株。 结论 我院存在大肠埃希菌喹诺酮耐药菌株，且耐药菌株耐药机制复杂，耐药基因的产生及酶类耐药突变是主要原因，临床要加强对耐药菌株的检测。

[关键词] 大肠埃希菌；喹诺酮；抗生素；耐药基因

[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）10-0080-03

大肠杆菌是临床常见的致病菌，大肠埃希菌是其中最常见的菌属，伴随近年来抗菌药物的临床应用及抗生素的不断发展，大肠埃希菌的耐药菌株不断出现，且耐药性不断提高，耐药机制日趋复杂，如细菌酶类耐药突变、耐药基因的突变表达等，近年来质粒耐药机制相关的质粒基因如qA、qB等成为研究热点[1，2]，质粒具有可转移性，其不仅能够导致耐药菌株对抗生药的耐药，而且能够引起耐药性在不同菌株之间的传递，导致菌株广泛耐药，严重影响临床治疗效果，目前临床已经分离出多个耐药基因，本研究就qA、qB、aac-（6’）-Ib-c等耐药基因在耐药性大肠埃希菌的表达及其作用机制进行研究，为大肠埃希菌耐药菌株的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

选择我院2010年1月～2012年6月临床分离的非重复84株大肠埃希菌菌株，分离菌株均经VITEK2-compact 微生物鉴定系统鉴定到种，质控菌株为大肠埃希菌 ATCC 25922菌株，结合实验菌株为大肠埃希菌J53 AzR菌株。所有菌株均深低温保存，临用前复苏。

1.2 主要仪器及试剂

环丙沙星（CIP）药敏纸片、左氧氟沙星（LVX）药敏纸片、诺氟沙星药敏纸片（NFX）、司帕沙星（SPX）药敏纸片、氧氟沙星（OFX）药敏纸片购自武汉博士德生物试剂公司，平板琼脂购自浙江碧云天生物试剂公司，肉汤培养基购自南京建成生物工程研究所，Taq、dNTPs、DNA MarkerⅢ及DNA 100 bp Ladder 购自美国Sigma公司，Tanon EPS-100型电泳仪购自北京原平皓生物技术有限公司，VITEK2-compact微生物鉴定系统购自法国梅里埃公司，梯度 PCR 仪购自德国 Eppendorf公司，UVP 凝胶成像系统购自美国Sigma公司。

1.3 药敏实验及菌株筛选

菌株耐药性检测采用纸片扩散法进行药敏实验，检测5种喹诺酮类药物（环丙沙星药、左氧氟沙星、诺氟沙星、司帕沙星片、氧氟沙星），药敏试验结果参照2009年版CLSI M100-S19规定执行，选择耐药菌株培养进行实验。

1.4 MIC值测定

抗生素最低抗菌药物浓度测定采用微量肉汤稀释法测定，测定药物选择环丙沙星，质控菌株为大肠埃希菌 ATCC 25922菌株。

1.5 PCR反应

采用煮沸法制备模板，印务设计参照GenBank基因图谱设计引物，引物序列如下：qA 上游引物：5’-ATTTCTCACGCCAGGATTTG-3’，下游引物：5’-GATCGGCAA AG GTTAGGTCA-3’，扩增片段730 bp；qB上游引物：5’-GATCG TGAAA GCCAGA AAGG-3’，下游引物：5’-ACGATG CCTGGTAGT TGTCC-3’，扩增片段469 bp；aac-（6’）-Ib-cr上游引物：5’-G CTCACGCCAGGATT-3’，下游引物：5’-GATGCCTGGTAGTTGTCC-3’，扩增产物214 bp；gyrA上游引物：5’-TGGGCAATGA CTGG AA CA -3’，下游引物：5’-GGTCGGCCATCAGTTCAT-3’，扩增产物469 bp； parC上游引物：5’-GCGAACG ATTT CGGATCGTC-3’，下游引物：5’-CTGAATGCCAGCGCCAAATT-3’，扩增产物423bp。qA、qB及aac-（6’）-Ib-cr扩增条件95℃变性，55℃退火，72℃延伸，45个循环，gyrA及parC扩增条件94℃变性、55℃退火，72℃延伸，45个循环，PCR反应完毕后，反应产物进行凝胶琼脂电泳，割取目的条带，gyrA及parC扩增产物进行测序，测序过程由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

2 结果

2.1 药敏实验及菌株筛选结果

84株临床分离的大肠埃希菌菌株中有24株对喹诺酮类药物耐药，耐药率28.4%。所有耐药菌株均对环丙沙星耐药。其中对2种药物耐药4株（CIP、LVX耐药2株，CIP、OFX耐药2株），发生率4.7%，对3种药物耐药6株（CIP、LVX、OFX耐药3株，CIP、OFX、SPX耐药2株，CIP、SPX、NFX耐药1株），发生率7.1%，对5种药物耐药14株，发生率16.7%，将24株耐药菌分别编号为1～24。

2.2 耐药菌株对环丙沙星MIC变化情况

对24株耐药菌株进行MIC检测，对照菌株大肠埃希菌 ATCC25922菌株。对照菌株环丙沙星MIC<0.094 μg/L，1～24号耐药菌株MIC值（14～56） μg/L，耐药菌株MIC值较对照菌株增加148～596倍。

2.3 耐药基因检测及测序结果

对24株耐药菌株进行PCR反应，目的基因扩增，其中检出qA质粒基因12株，qB质粒基因4株，aac-（6’）-Ib-cr基因4株（图1）。基因测序结果显示GyrA基因喹诺酮决定区突变11株，ParC基因决定区突变4株。基因测序结果显示，GyrA基因突变的11个菌株中83位丝氨酸（Ser）被亮氨酸（Leu）取代9株，被天冬酰胺（Asn）取代2株，ParC基因突变4个菌株中87位天冬酰胺（Asn）被甘氨酸（Gly）取代2株，被酪氨酸（Tyr）取代2株。在耐药菌株中，5份菌株单独检出qA，1份菌株单独检出qB，8份菌株单独检出GyrA基因区突变，1份菌株检出qA及qB基因，2份检出qA基因及aac-（6’）-Ib-cr基因突变，2份检出qA基因及ParC突变，1份检测出aac-（6’）-Ib-cr及GyrA突变，1份检出qB及aac-（6’）-Ib-cr，1份检出qB及GyrA突变，1份检出qA、qB及ParC突变，1份检出qA、qB及GyrA突变，见表1。

3 讨论

大肠埃希菌是大肠杆菌属的主要成员之一，在人体及外部环境中广泛存在，也是主要的致病菌属之一。近年来的流行病学研究发现，包括大肠杆菌在内的革兰阴性菌属的耐药性不断提高，给感染患者的临床治疗带来困难，革兰阴性菌的耐药谱分布较为广泛，甚至在应用其高度敏感的喹诺酮类药物时，也存在大量的耐药菌株，导致临床抗菌治疗的疗效下降，甚至无效。革兰阴性菌的耐药机制较为复杂，如药物作用靶位基因的突变，外排泵的表达等均能引起药物耐药。Qrn基因是近年来研究发现的与革兰阴性菌耐药有关的耐药基因，包括qrnA、qrnB及qS等多个亚型[3，4]，在qrn表达的菌株，能够引起对抗菌药物的敏感性下降，MIC值上升，但是大部分菌属仍能保持对抗菌药物一定程度的敏感性[5]，部分菌株可能并不引起完全耐药，但是其危害程度并不因为其对抗菌药物的影响偏小而减轻，由于其属于质粒基因，能够在相同或不同菌株的细菌间结合转移，甚至在不同菌属中进行水平传递，引起细菌耐药性的传播扩散。

大肠埃希菌是大肠杆菌属在人体分布最广的菌株，近年来的研究结果显示在大肠杆菌属中有喹诺酮耐药菌株的存在，我们对临床患者痰液、胆汁及体液等标本进行分离检测，分离出的84株临床大肠埃希菌菌株有24株对喹诺酮药物不同程度耐药，而且同一菌株对多种喹诺酮类药物耐药的情况较为多见，利用环丙沙星对耐药强度进行检测发现，耐药菌的MIC明显上升。在对大肠埃希菌的耐药机制进行深入研究发现，在24株耐药的大肠埃希菌中，部分菌株有qA、qB、aac-（6’）-Ib-cr基因检出及GyrA和ParC喹诺酮位点突变，而且在同一菌株中，常存在多种耐药基因同时存在的情况，如qA及qB基因同时存在， qA基因和aac-（6’）-Ib-cr基因突变同时存在以及qA基因和GyrA喹诺酮位点突变同时存在等。q基因编码的蛋白质能够同DNA回旋酶GyrA及拓扑异构酶ParC喹诺酮位点结合，导致其免受喹诺酮类药物的攻击，保持细菌DNA的转录及复制能力，在研究中发现，在q表达的大肠埃希菌中，同时也存在DNA回旋酶GyrA及拓扑异构酶ParC喹诺酮位点氨基酸突变的情况，进一步导致其对喹诺酮类的敏感性下降，最终导致菌株耐药[6，7]。aac（6’）-Ib-cr是氨基糖苷乙酰化转移酶的变异基因，是近年来发现的与喹诺酮耐药相关的基因[8，9]，在aac（6’）-Ib-cr表达的菌株，能够对进入细胞的喹诺酮类药物如环丙沙星等进行乙酰化修饰[10，11]，使药物对GyrA及ParC喹诺酮敏感区的作用能力下降，进而使细菌对喹诺酮类药物的敏感性下降。既往研究显示[12，13]，aac（6’）-Ib-cr单独表达的菌株，其对环丙沙星的MIC上升3-4倍，虽然aac（6’）-Ib-cr通过乙酰化药物起作用，对细菌耐药基因无明显的修饰作用，其在结肠埃希菌的耐药机制中作用较小，但是当aac（6’）-Ib-cr表达同时存在qA、qB等耐药基因时，其作用将进一步加强，最终导致菌株耐药[14]。

研究结果显示，在我院分离的大肠埃希菌临床菌株中，耐药菌株的比例较高，而且存在qA、qB、aac-（6’）-Ib-cr等质粒介导的耐药基因存在，有引起耐药菌株广泛播散的可能，耐药基因的存在及喹诺酮敏感区酶类基因突变是引起大肠埃希菌耐药的主要原因[15]，菌株耐药机制较为复杂，对多种喹诺酮类药物耐药，需要加强临床监测，避免耐药菌株在临床的传播。

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（收稿日期：2013-01-25）