丙泊酚抑制胶质瘤细胞侵袭和转移的内质网应激机制

对照组（C组）、2 μg/ml组、5 μg/ml组和10 μg/ml组， 分别加入浓度为0、2、5和10 μg/ml丙泊酚溶液。采用MTT法检测细胞活力;Transwell侵袭迁移测定侵袭细胞数;划痕实验测定迁移率;Western blot检测细胞葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）表达。比较每组细胞细胞活力、侵袭细胞数、迁移率及GRP78和CHOP表达。结果 2、5和10 μg/ml组胶质瘤细胞活力低于C组， 且随丙泊酚剂量增加胶质瘤细胞活力及迁移率逐渐降低， 差异有统计学意义（P<0.05）。2、5和10 μg/ml组胶质瘤细胞侵袭细胞数少于C组， 2 μg/ml组胶质瘤细胞侵袭细胞数多于5、10 μg/ml组， 差异有统计学意义（P<0.05）。

C组与5、10 μg/ml组胶质瘤细胞GRP78表达比较， 差异有统计学意义（P<0.05）。2 μg/ml组与5、10 μg/ml组胶质瘤细胞GRP78表达比较， 差异有统计学意义（P<0.05）。5 μg/ml组与10 μg/ml组胶质瘤细胞GRP78表达比较， 差异有统计学意义（P<0.05）。C组与2、5和10 μg/ml组胶质瘤细胞CHOP表達比较， 差异有统计学意义（P<0.05）。10 μg/ml组与2、5 μg/ml组胶质瘤细胞CHOP表达比较， 差异有统计学意义（P<0.05）。结论 丙泊酚可抑制人胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力， 其机制可能与激活内质网应激标志蛋白GRP78和CHOP表达变化有关。

【关键词】 丙泊酚;胶质瘤细胞;内质网应激

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.31.105

Endoplasmic reticulum stress mechanism of propofol inhibiting invasion and metastasis of glioma cells   RUAN Lin， ZHU Zhuo-li， LIAN Xiao-qiang， et al. Department of Anesthesia， Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510260， China

【Abstract】 Objective   To observe the effect of propofol on invasion and metastasis of glioma cells， and discuss the mechanism of endoplasmic reticulum stress （ERS） in invasion and metastasis of glioma cells. Methods  Human glioma cell line U87-MG was divided into control group （group C）， 2 μg/ml group， 5 μg/ml group and 10 μg/ml group， and propofol solution was added at concentrations of 0， 2， 5 and 10 μg/ml， respectively. Cell viability was detected by MTT assay， number of invasive cell by Transwell invasion and migration assay， migration rate by scratch assay， and expression of cell glucose regulatory protein 78 （GRP78） and CCAAT / enhancer binding protein homologous protein （CHOP） by Western blot. Cell viability， number of invasive cell， migration rate and expression of GRP78 and CHOP were compared in each group. Results  The cell viability of glioma cells in 2， 5 and 10 μg/ml group was lower than that in group C， and the cell viability and migration rate of glioma cells decreased with the increase of propofol dosage， the difference was statistically significant （P<0.05）. The number of invasive cell of glioma cells in 2， 5 and 10 μg/ml group was lower than that in group C， and 2 μg/ml group was more than 5 and 10 μg/ml group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. There was statistically significant difference in expression of GRP78 of glioma cells in group C and 5 and 10 μg/ml group （P<0.05）. 2 μg/ml group and 5 and 10 μg/ml group had statistically significant difference in expression of GRP78 of glioma cells （P<0.05）. 5 μg/ml group and 10 μg/ml group had statistically significant difference in expression of GRP78 of glioma cells （P<0.05）. Group C and 2， 5 and 10 μg/ml group had statistically significant difference in expression of CHOP of glioma cells （P<0.05）. 10 μg/ml group and 2， 5 μg/ml group had statistically significant difference in expression of GRP78 of glioma cells （P<0.05）. Conclusion   Propofol inhibits the invasion and migration of human glioma cells， and its mechanism may be related to the activation of endoplasmic reticulum stress marker proteins GRP78 and CHOP.

【Key words】 Propofol; Glioma cells; Endoplasmic reticulum stress

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤， 胶质瘤细胞的高度增殖性和侵袭性是其主要的病理特征， 是预后不良的主要原因[1]。丙泊酚化学名为2， 6-二异丙基苯酚， 是一种静脉麻醉药物， 常用于全身麻醉的诱导和维持， 特点是起效快， 持续时间短， 苏醒迅速而平稳， 不良反应少， 广泛应用于各种外科手术中。研究发现丙泊酚在许多肿瘤， 如肺癌、胃癌和结肠癌等中有抗肿瘤的作用[2]。内质网应激（endoplasmic reticulum stress， ERS）促肿瘤侵袭是肿瘤调控的新机制[3]。

1 材料与方法

1. 1 细胞培养 人胶质瘤细胞系U87-MG细胞常规培养。在10%胎牛血清含青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 mg/L）的1640培养基中， 37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。

1. 2 实验分组 人胶质瘤细胞系U87-MG细胞培养分为4组（n=24）：对照组（C组）、2 μg/ml组、5 μg/ml组和10 μg/ml组， 分别加入浓度为0、2、5和10 μg/ml丙泊酚溶液， 孵育6 h后换培养液， 继续培养18 h。

1. 3 MTT法测定 人胶质瘤细胞系U87-MG细胞密度为5×104/ml， 接种于96孔板中， 每孔200 μl。各组取6孔， 每孔加入含MTT浓度为5 mg/ml的PBS 20 μ1， 培养4 h待甲躜结晶形成后加入二甲基亚砜150 μl， 置于酶标仪570 nm波长下测定吸光度值， 反映细胞活力。

1. 4 Transwell侵袭迁移测定 细胞侵袭与迁移能力测定采用24孔Transwell小室和Matrigel（B&D公司）。细胞培养至80%融合时， 收集细胞， 调整细胞数为5×105/ml;Transwell下室中加入600 μl含丙泊酚处理 RPMI 1640培养液孵育40 h。0.1%结晶紫染色15 min， 每个滤膜随机在显微镜下选取8个高倍视野（×200）， 计数穿过聚碳酯膜的细胞。

1. 5 细胞划痕实验 细胞接种6孔板至细胞80%融合， 各组取6孔， 用20 μl无菌枪头做垂直于孔板长缘的均匀划痕。以100倍视野摄片并标记摄片位置（T0）， 培养24 h在相同位置再次摄片（T1）。用Image Pro Plus软件拍摄照片的划痕距离， 计算细胞迁移率=（T0距离-T1距离）/T0距离×100%。

1. 6 Western blot检测 细胞加入蛋白裂解液及PMSF， 超声破碎， 4℃、12000 r/min离心40 min， 取上清。用Bradford法对上清做蛋白定量。取20 μg蛋白作10% SDS-PAGE电泳， 100 V转移1 h至PVDF膜， 葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein78， GRP78）和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein， CHOP） 4℃過夜。将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗IgG抗体孵育， 用ECL化学发光试剂观察条带。用不含抗体TBST液孵育作阴性对照。图像分析测定各带作定量分析， 以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值反映蛋白的表达。

1. 7 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2、5和10 μg/ml组胶质瘤细胞活力低于C组， 且随丙泊酚剂量增加胶质瘤细胞活力逐渐降低， 差异有统计学意义（P<0.05）。2、5和10 μg/ml组胶质瘤细胞侵袭细胞数少于C组， 2 μg/ml组胶质瘤细胞侵袭细胞数多于5、10 μg/ml组， 差异有统计学意义（P<0.05）。而5和10 μg/ml P组侵袭细胞数比较， 差异无统计学意义（P>0.05）。2、5和10 μg/ml组胶质瘤细胞迁移率低于C组， 且随丙泊酚剂量增加胶质瘤细胞迁移率逐渐降低， 差异有统计学意义（P<0.05）。C组与2 μg/ml组胶质瘤细胞GRP78表达比较， 差异无统计学意义（P>0.05）。

C组与5、10 μg/ml组胶质瘤细胞GRP78表达比较， 差异有统计学意义（P<0.05）。2 μg/ml组与5、10 μg/ml组胶质瘤细胞GRP78表达比较， 差异有统计学意义（P<0.05）。5 μg/ml组与10 μg/ml组胶质瘤细胞GRP78表达比较， 差异有统计学意义（P<0.05）。C组与2、5和10 μg/ml组胶质瘤细胞CHOP表达比较， 差异有统计学意义（P<0.05）。10 μg/ml组与2、5 μg/ml组胶质瘤细胞CHOP表达比较， 差异有统计学意义（P<0.05）。2 μg/ml组与5 μg/ml组胶质瘤细胞CHOP表达比较， 差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3 讨论

丙泊酚在体外实验中抑制HeLa细胞株、HT1080细胞株、黑色素瘤细胞株的侵袭， 在小鼠骨肉瘤模型中丙泊酚可降低小鼠骨肉瘤细胞株LM8的肺转移[4]。丙泊酚作用于人乳腺癌细胞， 抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）信号途径， 从而抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移[5]。小剂量丙泊酚能够促进食管鳞癌细胞Ecal09的增殖、迁移与侵袭并抑制凋亡[6]。丙泊酚对肿瘤生物学行为影响的研究尚存在争议。

GRP78是熱休克蛋白70（HSP70）家族成员之一， 在成熟组织中表达量很低， 但ERS时可大量产生， 与肿瘤细胞的侵袭转移、耐药等密切相关[7]。CHOP属于C/EBP家族成员之一， 参与ERS介导细胞凋亡的特有途径[8]。本实验采用人胶质瘤细胞进行研究， 以不同剂量浓度丙泊酚处理胶质瘤细胞活力、侵袭细胞数、迁移率下降， GRP78和CHOP表达下调。

综上所述， 丙泊酚可抑制人胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力有一定抑制作用， 其机制与ERS有关， 为丙泊酚在胶质瘤围术期应用提供理论基础。

参考文献

[1] Carabenciov ID， Buckner JC. Controversies in the therapy of low-grade gliomas. Curr Treat Options Oncol， 2019， 20（4）：25.

[2] Sun H， Gao D. Propofol suppresses growth， migration and invasion of A549 cells by down-regulation of miR-372. BMC Cancer， 2018， 18（1）：1252.

[3] Grootjans J， Krupka N， Hosomi S， et al. Epithelial endoplasmic reticulum stress orchestrates a protective IgA response. Science， 201， 363（6430）：993-998.

[4] Mammoto T， Mukai M， Mammoto A， et al. Intravenous anesthetic， propofol inhibits invasion of cancer cells. Cancer Lett， 2002， 184（2）：165-170.

[5] Li Q， Zhang L， Han Y， et al. Propofol reduces MMPs expression by inhibiting NF-κB activity in human MDA-MB-231 cells. Biomed Pharmacother， 2012， 66（1）：52-56.

[6] 张灵敏， 张明鑫， 王宁， 等. 小剂量丙泊酚对食管鳞癌细胞Ecal09生物学行为的影响. 细胞与分子免疫学杂志， 2011， 27（4）：402-404.

[7] Bailly C， Waring MJ. Pharmacological effectors of GRP78 chaperone in cancers. Biochem Pharmacol， 2019（163）：269-278.

[8] Wang Y， Wang K， Jin Y， et al. Endoplasmic reticulum proteostasis control and gastric cancer. Cancer Lett， 2019（449）：263-271.

[收稿日期：2019-03-20]