血液中肺炎链球菌的AFLP快速检测方法的建立

[摘要] 目的 建立扩增片段长度多态性（AFLP）快速检测血液中肺炎链球菌的方法。方法 针对肺炎链球菌的管家基因16SrRNA基因设计特异引物，优化反应条件，建立肺炎链球菌的AFLP检测方法。通过对模拟临床血液感染细菌标本的检测，评价该方法的特异性和灵敏度。结果 7个模拟临床血液感染肺炎链球菌标本经AFLP法检测，结果均为阳性；15个模拟临床血液感染非肺炎链球菌标本经该法检测，结果均为阴性；该法检测血液标本中肺炎链球菌的灵敏度为1.5×104cfu/mL。结论 建立的AFLP方法检测血液中肺炎链球菌简便快速，特异性好、灵敏度高，适合肺炎链球菌血流感染的早期诊断。

[关键词] 肺炎链球菌；扩增片段长度多态性；快速检测

[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）34-83-03

Establishment and Application of AFLP Method for Rapid Diagnosis of Streptococcus Pneumoniae in Blood1

YU Lingling1 WANG Xinlin2 WU Xiuji1 ZHENG Xueyun2

1.The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325027, China；2.The First People"s Hospital of Longwan, Wenzhou 325024, China

[Abstract] Objective To establish a Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) method for rapid diagnosis of Streptococcus pneumonia. Methods Based on the 16S rRNA nucleic sequence of streptococcus pneumonia, a pair of primers was designed for AFLP. The reaction conditions were optimized, and the specificity, sensitivity, and practicability of AFLP were tested using 7 streptococcus pneumonia strains and 15 non-streptococcus pneumonia strains in blood. Results All the 7 strains of streptococcus pneumonia in blood yielded positive results in AFLP, and the 15 strains of other bacteria in blood all showed negative results. The results of streptococcus pneumonia count showed that AFLP was capable of detecting streptococcus pneumonia at a level as low as 1.5×104cfu/ml in blood. Conclusion The established AFLP method has high specificity and sensitivity for detecting streptococcus pneumonia in blood and is applicable in field of rapid diagnosis of Streptococcus pneumoniae in blood.

[Key words] Streptococcus pneumoniae; Amplified fragment length polymorphism; Rapid detection

肺炎链球菌是一种条件致病菌，当机体免疫力下降时可以致病，肺炎链球菌是社区获得性肺炎、脑膜炎、中耳炎及败血症等的主要病原体[1-2]。血液中检出肺炎链球菌也很常见，国内多见报道。目前对肺炎链球菌的诊断主要依赖传统培养法进行检测，但是培养法需要对微生物分离、培养和鉴定等，检测存在着耗时长、灵敏度低、操作繁琐等缺点，对临床快速诊断尤其是侵袭性感染的诊断不及时，造成临床治疗上的延误。随着分子生物学技术的发展，肺炎链球菌的快速诊断研究进展迅速，有环介导等温核酸扩增技术（LAMP）、PCR检测核糖体（16S rRNA）、荧光定量PCR、荧光探针等[3-6]从基因/基因组的层面对肺炎链球菌进行快速诊断。本研究拟建立扩增片段长度多态性（AFLP）方法以检测肺炎链球菌，并对模拟临床血液感染细菌标本进行检测。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

制备模拟临床血液感染细菌标本所用菌株为2010年4～6月温州医学院附属第二医院及温州市龙湾区第一人民医院临床分离株；质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619，购自卫生部临床检验中心。

1.2 仪器

Microscan Walkaway-90SI 型全自动细菌鉴定仪（德国西门子公司）、VITEK-32全自动微生物分析仪、PCR仪（德国Eppendorf 公司产品）、电泳仪（美国BIO. RAD公司）、凝胶成像系统（上海天能公司）。

1.3 试剂

PCR试剂和DNA Marker I 购于TaKaRa大连宝生物公司，引物参照文献设计[7]，由上海生工生物技术有限公司合成。限制性内切酶EcoR I、Mse I 购自Fermentas公司，DNA 分子量对照购自MBI公司。接头EcoR I Adapter，Mse I Adapter、引物序列（P1、P2），见表1。

1.4 菌种鉴定及药敏试验

挑选血平板上脐窝状的可疑菌落分纯，同时做奥普托欣（Optochin）试验，再用VITEK-32全自动微生物分析仪GPI卡鉴定到种。试剂盒ATBSTREP5为法国生物梅里埃公司产品，判断标准参照CLSI（2010版）标准。

1.5 AFLP 实验

根据胡农等[8]报道的方法改进后用于实验。

1.5.1模拟临床血液感染细菌标本制备及DNA的提取 挑3-5个菌落调制成1麦氏点菌液.相当菌液初始浓度为3.0×108cfu/mL，与血液对倍混合，即得到系列浓度为1.5×108cfu/mL模拟临床血液感染细菌标本。收集所配制的临床血液细菌标本置入含50μL裂解液（0.5%非离子去污剂NP40配制的浓度为200ng/mL蛋白酶K溶液）的0.5mL离心管内，置55℃水浴1h，置95℃水浴灭活15min，14000r/min，离心30s。上清液即为扩增检测的模板液，用1%琼脂糖电泳检测基因组DNA，并用紫外分光光度计定量。

1.5.2 基因组DNA的双酶切 取基因组DNA各2μL，内切酶EcoR I 5U、MseI 5U，10×Buffer 4μL，补水至40μL，先在37℃水浴5h，然后转入65℃水浴2h，用1%琼脂糖电泳检测酶切产物。

1.5.3 接头的连接反应 取酶切产物20μL，EcoR I Adapter、Mse I Adapter 各1μL，T4 DNA连接酶0.5μL，10×Buffer 3μL，补水至30μL，22℃，连接过夜。

1.5.4 PCR扩增 PCR扩增反应体系体积为25μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，dNTP（100mmol/L）2μL，模板DNA 3μL，MgCl2（25mmol/L）1.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，EX Taq酶（5U/μL）0.125μL，ddH2O 14.375μL，混匀后进行扩增反应。循环参数为：94℃预变性 4min，然后94℃ 15s→65℃ 30s→72℃ 15s共40个循环，最后72℃延伸10min。

1.5.5 电泳分析 将产物放在6%的琼脂凝胶中，150V电泳20min后用凝胶成像仪观察DNA条带的分布并对其基因进行分型。

1.6 模拟临床血液感染肺炎链球菌标本的检测

将临床分离获得的非重复的7株肺炎链球菌纯培养后，分别制成模拟临床血液感染细菌标本并进行DNA提取，AFLP检测，用肺炎链球菌ATCC49619做阳性对照。

1.7 特异性实验

将临床分离获得的15株非肺炎链球菌（包括：铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、宋内志贺菌、伤寒沙门菌、粘质沙雷菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌）纯培养后分别制成模拟临床血液感染细菌标本并进行DNA提取，AFLP检测。同时用肺炎链球菌ATCC49619做阳性对照，以无菌蒸馏水做空白对照。

1.8 灵敏度实验

将肺炎链球菌标准菌株纯培养后，10倍梯度稀释配制成浓度依次为3×108cfu/mL、3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL、3×102cfu/mL的菌液，与血液对倍混合，即得到系列浓度为1.5×108cfu/mL、1.5×107cfu/mL、1.5×106cfu/mL、1.5×105cfu/mL、1.5×104cfu/mL、1.5×103cfu/mL、1.5×102cfu/mL的模拟临床血液感染肺炎链球菌标本，提取DNA，AFLP检测，以无菌蒸馏水做空白对照。

2 结果

2.1 AFLP法检测模拟临床血液感染肺炎链球菌标本的结果

7个模拟临床血液感染肺炎链球菌标本经AFLP 法检测，结果均为阳性，见图1。

2.2 特异性实验

15个模拟临床血液感染非肺炎链球菌标本经AFLP法检测，结果均为阴性，见图2。

6.大肠埃希菌 7.肺炎克雷伯菌 8.产气肠杆菌 9.阴沟肠杆菌 10.宋内志贺菌 11.伤寒沙门菌 12.粘质沙雷菌 13.鲍曼不动杆菌 14.嗜麦芽窄食单胞菌 15.洋葱伯克霍尔德菌 16.肺炎链球菌ATCC49619

2.3 灵敏度实验

AFLP 方法检测模拟临床血液感染肺炎链球菌标本，可检测到第5个稀释度，则其检测灵敏度为1.5×104cfu/mL，见图3。

3 讨论

肺炎链球菌血液感染可继发于肺炎链球菌性肺炎中耳炎、乳突炎、咽炎，病菌大多由肺部经引流淋巴径路经胸导管人血，中耳炎及乳突炎时则肺炎链球菌可经静脉窦入血，肺炎链球菌肺炎患者中20%～30%血培养阳性，阳性率随年龄增长而增加。脾切除患者发生较多，可能与脾脏的单核-吞噬细胞系统具有强大的吞噬与杀灭有荚膜的肺炎链球菌的功能有关。其他原有重症疾病如镰状细胞贫血及免疫功能低下患者，均易发生肺炎链球菌败血症。

随着肺炎链球菌血源性感染的逐渐增多[9]，快速鉴定及药敏分析、指导临床合理使用抗菌药物是治疗肺炎链球菌血液感染的主要途径。然而目前，传统细菌培养分离生化鉴定方法作为细菌诊断的金标准，检测血液中肺炎链球菌，需要先进行增菌，而后采用血平板培养等，从微生物分离培养和形态学鉴定到生化分析，整个确诊过程至少需3～5d；而对于临床上肺炎链球菌所致血液感染，该法不能满足要求。近年来，以PCR 技术为代表的病原核酸检测技术得到不断发展，如LAMP、PCR检测16SrRNA、荧光定量PCR、荧光探针等。然而这些方法虽然可用于快速检测，但需要特殊而昂贵的仪器才能实现，检测费用较高，在现场使用有一定的局限性。AFLP检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，是对各种微生物进行快速分型、鉴定及流行病学调查等研究的一种较理想的分子生物学方法[10-11]。因此我们采用该技术建立了AFLP检测血液中肺炎链球菌的方法，并通过对模拟临床血液感染细菌标本的检测，对其特异性和灵敏度进行评价。

本研究中选择肺炎链球菌的特异基因作为靶序列，设计了两对引物，对基因组DNA进行双酶切后链接，优化反应条件，选择适宜的反应液配方，建立了AFLP检测血液中肺炎链球菌的方法，并将其应用于模拟临床血液感染细菌标本的检测。结果表明，本研究所用7个模拟临床血液感染肺炎链球菌标本用AFLP法检测，均显示阳性结果；而15个模拟临床血液感染非肺炎链球菌（包括金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌等革兰阳性菌，也包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等革兰阴性菌）标本，用该法检测均未出现阳性结果，说明该法不仅可用于临床血液中感染肺炎链球菌的检测，而且结果特异，未出现假阴性和假阳性结果。此外，由灵敏度实验结果可知，该法最低可检测到1.5×104cfu/mL的肺炎链球菌，与其他PCR快速诊断检测水平相当[3-6]；

根据上述实验结果，我们认为所建立的AFLP检测血液中肺炎链球菌的方法简便快速、特异性好、灵敏度高，适合肺炎链球菌血流感染的早期诊断。

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（收稿日期：2011-09-06）