生姜拮抗性内生细菌的筛选

摘 要：从乐山市售生姜根状茎中分离纯化内生细菌，并以金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大肠杆菌 （Escherichia coli （E.coli））、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）为靶标菌进行抑菌试验。研究结果表明：生姜中存在大量的内生细菌，分离获得的9个菌株对四种靶标菌都有不同程度的抑菌作用，2个菌株（SJ1 and SJ9）抑菌效果非常显著，相对抑菌率超过170%。

关键词：生姜 内生细菌 分离 拮抗作用 筛选

中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）04（c）-0154-03

生姜（Zingiber officinale Roscoe）在中药中是一种很重要的药用植物，由于其性辛辣的特点，有发汗、驱寒、止呕、解毒等多种功能[1]，生姜中的一些代谢产物还具有良好的降胆固醇、抑菌、抗衰老、抗癌、防血凝、抗氧化及防腐等作用，如姜黄、姜精油[2]。生姜内生细菌是指存在于生姜组织和器官内部的细菌，根据相似相溶原理，生姜内生细菌可能具有生姜相同的抑菌效果[3]，可作为重要的天然抑菌材料来源进行研究。

由于生姜的病变很少，本研究基于生姜内生细菌可能具有抑菌功效的思想，从生姜组织中分离纯化内生细菌，并筛选对金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大肠杆菌 （Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）有抑菌作用的菌株，为利用植物内生细菌资源开发抑菌新药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

从乐山各市场购买市售食用生姜。

1.2 靶标菌

S.aureus、E.coli、B.subtilis、MRSA，由本校病理实验室提供。

1.3 培养基

马铃薯葡萄糖培养基（分离纯化培养基）：马铃薯200 g，葡萄糖5 g，琼脂粉16 g，纯净水1000 ml，pH自然[4]。

马铃薯琼脂培养基（PDA）（拮抗筛选培养基）：马铃薯200 g，削皮煮汁，葡萄糖5 g，琼脂粉20 g，水1000 ml，pH7.0[5]。

1.4 生姜内生菌的分离纯化

生姜的表面消毒：取无病无霉变的完整生姜块根（约30 g），用自来水冲洗5 min，冲洗表面的泥土等污物，放于已灭菌的培养皿中，无菌水反复冲洗3～5次，5%次氯酸钠洗涤3次，无菌水冲洗3～5次，收集最后一次冲洗液做无菌检验[6]。

分离纯化：在无菌条件下，分别用灭菌后的解剖刀切割表面消毒完全的生姜块根成直径为0.5 cm方形的小块，用无菌镊子将姜块放于马铃薯葡萄糖培养基上不同的地方，每个平板均匀摆放3～4块，置于28 ℃培养，每隔12 h观察一次，培养2～3 d时间。待培养皿上出现单菌落时，根据菌落的形态、颜色、大小将其分类后采用平板划线法接种到新鲜平板上培养，直到获得单菌落为止[7～8]，纯化后的菌株保存于斜面中备用。

1.5 平板对峙法初筛

内生细菌活化后涂布接种在平板上培养24 h后，在无菌条件下用0.5 cm打孔器制打成菌饼[9～10]，将菌饼放置于涂布接种有四种靶标菌的平板上，28 ℃培养，每隔12 h观察一次，培养48 h后用十字交叉法测定抑菌圈的大小[11～12]，每处理重复三次，以无菌的培养基打孔代替菌饼做为对照（CK）[13]。相对抑菌率（%）=（抑菌圈直径-菌饼直径）/菌饼直径×100%。

1.6 牛津杯法复筛

直接垂直插上已灭菌的牛津杯，轻轻加压（注意不能与培养皿底部接触）[14]，使其与培养基接触无空隙，每个平板插4个牛津杯，将初筛中有拮抗活性的菌株菌悬液100 ul加入到牛津杯中，置28 ℃培养48 h[15]，十字交叉法测量抑菌圈直径大小，记录数据。每种处理重复三次，以向牛津杯中加入100 ul的无菌水代替菌悬液做为对照（CK）。相对抑菌率（%）=（抑菌圈直径-菌饼直径）/菌饼直径×100%。

2 结果与分析

2.1 生姜内生细菌的分离纯化

通过反复分离纯化，并按照菌落、菌株形态、大小、颜色等特征进行区分，共获得9株可培养的内生细菌，依次编号为SJ1-SJ9。

2.2 拮抗菌株的初筛

对分离纯化得到的9株生姜内生菌菌株进行了皿内对峙法拮抗试验，9个菌株均具有不同程度的抑菌效果，其中有7个菌株对四种病原细菌的抑菌圈直径均大于12.5mm，相对抑菌率均超过150%（如表1）。

2.3 拮抗功能菌株得复筛

对初筛得到的7个菌株进行牛津杯法复筛，结果表明7个菌株对四种病原细菌都有不同程度的抑菌效果，其中SJ1和SJ9的抑菌效果比较明显，对四种病原细菌的抑菌圈直径超过13 mm，相对抑菌率超过170%（表2）。

3 结论与讨论

（1）因生姜内生细菌大多数具有抑菌作用，其中SJA和SJI抑菌圈的直径大于等于13.7 mm，具有较强的抑菌效果。在初筛过程中SJA对大肠杆菌、MRSA、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈大小依次为：13.8 mm、14.5 mm、13.7 mm、13.3 mm。在复筛过程中SJA对大肠杆菌、MRSA、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌抑菌圈的大小依次为：13.7 mm、13.7 mm、13.7 mm、13.8 mm。在初筛过程中SJI对大肠杆菌、MRSA、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌抑菌圈的大小依次为：13.1 mm、12.7 mm、13.4 mm、13.2 mm。在复筛过程中SJI对大肠杆菌、MRSA、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌抑菌圈的大小依次为13.7 mm、13.8 mm、13.8 mm、13.6 mm。

（2）本试验中，判断抑菌作用强弱的是抑菌圈的大小，此方法具有一定的局限性，通常只能定性判断内生细菌对靶标菌有无抑菌效果，不能确定内生细菌抑菌的机制。

（3）生姜内生细菌大多数具有很强的抑菌效果[16]，在医学方面新药的研发具有很高的研究价值，是一种重要的天然来源。

（4）本试验只是对生姜茎的内生细菌进行了分离和筛选，而叶等器官没有进行内生细菌的分离和筛选，还等进一步进行研究。

（5）本次试验中，SJ1和SJ9初筛和复筛过程中抑菌圈大小存在差异，二者之间是否存在一定的联系还不确定。

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