FQ—PCR和TRFIA联合检测乙肝标志物的应用探讨

【摘要】 目的：探讨FQ-PCR和TRFIA两种方法联合检测乙肝标志物的临床意义。方法：用荧光聚合酶链反应（FQ-PCR）对患者进行HBV-DNA检测，同时用TRFIA法定量测定HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc指标。结果：在1159例患者血清中检测出HBV-DNA病毒基因拷贝值范围为1.2×102～1.1×108 IU/ml，平均含量为3.65×106 IU/ml，总阳性检出率为52.3%；其中HBsAg（+）、HBeAg（+）、抗-HBc（+）血清中HBV-DNA阳性检出率93.8%（591/630）；HBsAg（+）、抗-HBe（+）、抗-HBc（+）血清中HBV-DNA阳性检出率43.2%（401/929）； HBsAg（+）、抗-HBc（+）血清中HBV-DNA阳性检出率80.0%（104/130）；HBsAg（+）、HBeAg（+）血清中HBV-DNA阳性检出率96.0%（24/25）；HBsAg（-）血清中HBV-DNA阳性检出率为7.8%（39/501）。结论：FQ-PCR可以检测HBV的真实感染和复制状态，TRFIA是一种效果好、准确度高、灵敏度高、特异性强、测量精度良好的自动化免疫分析方法，两种方法联合检测综合分析乙肝标志物含量，对判断患者的病情、检测感染状况及病毒的活跃程度都会具有较高的临床意义。

【关键词】 乙型肝炎病毒； 荧光定量聚合酶链反应； 时间分辨荧光免疫定量检测

中图分类号 R512.6 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2013）24-0068-02

据世界卫生组织（WHO）公布的数据，乙型肝炎病毒（HBV）感染已呈世界性流行，是一个全球性的公共卫生问题。目前，全球20亿人已感染，其中3.5～4亿人为慢性HBV携带者。HBV感染可以引起急性和慢性肝脏疾病，包括肝硬化和肝癌[1]。

我国属于HBV感染的高发区，资料表明全国约有1.2亿病毒携带者，3000万例慢性乙型肝炎患者，每年死于肝炎及其并发症的患者达数十万人[2]。HBV标志物检测既是临床感染诊断的基础，更是抗病毒治疗检测和预测的重要指标。本文采用荧光聚合酶链反应（FQ-PCR）检测HBV-DNA的含量，同时利用时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）对乙型肝炎标志物（HBV-M）进行定量检测，探讨用两种方法联合检测的临床意义，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2215例均为笔者所在医院2007-2012年同时采用FQ-PCR和TRFIA法检测的门诊和住院患者，男1398例，女817例，年龄10～78岁。

1.2 方法

1.2.1 HBV-DNA含量检测 FQ-PCR法：PCR仪是DA7600荧光PCR检测仪，试剂由达安基因诊断中心提供，并严格按照说明书进行操作，阳性标准为大于1×102 IU/ml。严格按照Kword等提出的防污染措施进行实验操作[3]。

1.2.2 HBV-M定量检测 TRFIA法：采用Anytest 2000时间分辨荧光检测仪及配套试剂，试剂由上海新波生物技术有限公司提供。阳性标准为：（1）HBsAg>0.2 ng/ml；（2）抗-HBs>10 mIU/ml；（3）HBeAg>0.5 NCU/ml；（4）抗-HBe> 0.2 NCU/ml；（5）抗-HBc>0.9 NCU/ml。操作步骤按说明书进行。

1.3 统计学处理

结果采取PEMS 3.1统计学软件处理，计量资料进行t检验，而计数资料采用字2检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

从表1可知：（1）FQ-PCR检测HBV-DNA总阳性率为52.3%，在2215份血清中共检出HBV-DNA阳性1159份。其中，1714份HBsAg（+）血清中，DNA阳性率为65.3%（1120/1714）；501份HBsAg（-）血清中，DNA阳性率为7.8%（39/501）；抗-HBs（+）、HBeAg（+）、抗-HBe（+）、抗-HBc（+）标志物中DNA阳性率分别9.0%（28/312）、93.9%（615/655）、34.5%（433/1254）、57.2%（1125/1966）。（2）HBsAg和HBeAg同时阳性组合中，DNA阳性率为93.9%（615/655）。根据HBV-M阳性组合分类进行分组，其中Ⅰ组HBV-DNA阳性率与Ⅱ组进行比较，Ⅰ组HBV-DNA阳性率高于Ⅱ组，差异有统计学意义（字2=16.45，P<0.01）。

3 讨论

荧光定量聚合酶链反应是在定性PCR基础上，添加一条荧光探针，且标记荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）两个基团。当荧光探针保持完整时，R的荧光信号被Q所淬灭；而在PCR反应中，Taq酶切断探针，R释放出荧光信号，检测其荧光信号强弱，即可反映HBV-DNA的浓度。该技术整个实验过程均在完全闭管的状态下进行，无需PCR后处理和冗长的电泳、紫外线或染色检测，解决了常规PCR实验不能准确定量及扩增产生污染而导致的假阳性，操作繁杂以及强烈致癌物溴化乙啶对操作人员的危害和污染环境问题，成为常规PCR的更新换代技术。据李金明[4]述评总结，目前，荧光定量PCR法是检测乙型肝炎病毒复制最敏感、应用广泛的技术。

TRFIA法基本原理是以镧系列元素铕（Eu）螯合物作为荧光标记物，具有长的荧光受命，可延长荧光测定时间，待短寿命的自然本底完全衰退后再测定，所得到的荧光信号为长寿命的镧系螯合物的荧光，从而有效地消除非特异性本底荧光干扰，提高其灵敏度和准确性，是一种对环境无污染，试剂稳定，方法较简便，出报告时间较快的新的测定技术。据冯炜[5]研究，时间分辨荧光免疫测定法能检测出低水平复制的乙型肝炎病毒，避免漏检，可反映病情变化和治疗效果，是一种理想的乙肝两对半定量检测方法，值得临床推广应用。

本实验结果显示FQ-PCR检测在2215份血清中共检出HBV-DNA阳性1159份，HBV-DNA总阳性率为52.3%，与易冬英等[6]研究相似；1714例HBsAg（+）血清中HBV-DNA（+）1120例，占65.3%；HBeAg（+）655例中有615例HBV-DNA（+），阳性率占93.9%；HBsAg和HBeAg同时阳性，HBV-DNA阳性率为93.9%；表明HBV-DNA与HBeAg呈线性正相关、病毒复制活跃、传染性强的观点是可靠的[7-8]。

另有40例HBsAg和HBeAg同时阳性以及594例HBsAg（+）血清中显示HBV-DNA（-），可能是HBV感染机体后，易与被感染的宿主细胞成整合状态，血中游离的HBV-DNA锐减，或是试剂盒本身的设计缺陷，引物与探针不能与靶DNA很好匹配，未能检出[9]，亦可能是正在接受生物疗法的患者，其血清病毒的复制受到了抑制或掩盖，但实验中TRFIA法仍可表达出HBsAg（+）。

临床上常将HBsAg、HBeAg、抗-HBc阳性称为“大三阳”，HBV-DNA阳性检出率93.8%（591/630），略低于文献[10]报道，而将HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性称为“小三阳”。结果显示，Ⅰ、Ⅱ组间差异有统计学意义（字2=16.45，P<0.01）；Ⅰ组“大三阳”HBV-DNA阳性率显著高于Ⅱ组“小三阳”HBV-DNA阳性率，与文献[11]报道相一致。

一般来说，抗-HBs（+）提示患者病程进入恢复期，无传染性，是一种保护性抗体出现的表现，但结果显示：单项抗-HBs（+）共76例，FQ-PCR检出3例HBV-DNA（+），阳性率为3.9%，说明血液中出现抗-HBs，未必说明病情转或HBV已被清除，仍有部分患者存在HBV-DNA复制，其原因可能是患者受到HBV亚型的双重感染，亦可能是患者自然感染HBV后，产生了免疫反应，但尚未能完全消除病毒，处于感染恢复早期。

通常认为，机体产生抗-HBe，被认为是预后良好的征象，本实验检测1254例抗-HBe（+），有433例HBV-DNA（+），阳性率34.5%，这可能是HBV的PreC区基因变异，使PreC区出现了终止密码子、使PreC基因不能与C基因共同转译出HBeAg，因而变异的毒株不能被抗-HBe及相应的细胞免疫所识别而清除，而HBV-DNA不断复制的结果。因此，对抗-HBe阳性患者的预后，应同时检测其血清中的病毒DNA[8]。

本次实验抗-HBs，抗-HBc同时阳性者159例，有21例HBV-DNA（+），阳性率为13.2%，与文献[8]报道大致相近。资料表明：有5%～15%的慢性乙肝患者的血清，其抗-HBC测定结果可以是阳性，当慢性病例病毒再次活动时尤为如此；另可能是由于FQ-PCR方法灵敏度更高，患者本身病毒滴度低，TRFIA未能检出而造成。

在HBsAg（+）1714例中，HBV-DNA（+）有1120例，阳性率65.3%；而本次实验结果也同时显示：在501份HBsAg（-）血清中，HBV-DNA（+）有39例，阳性率为7.8%，而HBV-DNA（+）表示HBV在体内复制。资料表明，只要有HBV-DNA就可以引起HBV感染[12-13]，因此临床上须在检测HBV-M的基础上，用FQ-PCR法检测HBV-DNA，方可确认有无传染乙肝病毒的可能，这不仅有诊断意义，而且也有流行病学意义。

乙型肝炎病毒标志物含量受人体免疫功能以及变异等多因素的影响，本次研究提示，若单纯依靠血清乙型肝炎病毒标志物的检测结果来进行诊断和判断病情是不够的，而HBV-DNA在检测时也容易受到一些人为或非人为因素的影响。因此，在进行临床工作中，最好用FQ-PDR和TRFIA两种方法联合检测综合分析患者体内乙肝病毒含量，这样对判断患者的病情、检测感染状况及病毒的活跃程度都会有较高的临床意义。

参考文献

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（收稿日期：2013-05-18） （编辑：何玉勤）