软枣猕猴桃多糖、黄酮提取工艺的优化及抗氧化活性

摘要：以提高软枣猕猴桃中的总黄酮、多糖提取为目标，经过提取方法对比及正交设计试验，优化总黄酮、多糖的提取工艺，研究其抗氧化活性。结果表明，影响提取工艺的因素由高到低为复合酶浓度>提取时间>料液比>提取功率，最佳工艺参数为05%纤维素+04%果胶复合酶浓度、料液比1 g ∶15 mL、提取时间10 min、微波功率300 W，此时其加权收率为6754 3，并经验证具有较好的稳定性；提取物浓度超过08 mgmL时，对羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除率在7000%以上。

关键词：软枣猕猴桃；总黄酮；多糖；提取工艺；优化条件；抗氧化；稳定性

中图分类号： TS2011文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）21-0199-03

收稿日期：2016-05-26

基金项目：牡丹江师范学院国家级课题培育项目（编号：GP201609）；牡丹江师范学院国家预研项目（编号：GY201307）；黑龙江省牡丹江市科技攻关（编号：G2014d1509、G2012d1082）。

作者简介：何婷婷（1983—），女，黑龙江牡丹江人，博士，讲师，从事药用植物学研究。E-mail：swxhtt@126com。

软枣猕猴桃（Actinidia arguta）为猕猴桃科猕猴桃属植物，果实多汁，富含维生素C、维生素B、胡萝卜素及衍生物质、皂苷、黃酮、多糖等多种药理活性成分1-2]，对高血压、心绞痛、高血脂、肿瘤等有一定疗效，其中多糖物质对胃肿瘤有显著抑制作用，抑制率高达964%3]，此外软枣还具有一定的降血糖、抗病毒、改善视力、提高耐力等作用4]。现代药理研究表明，软枣猕猴桃的药理作用与其含有黄酮、多糖等成分有密切关系，因此进一步加强软枣猕猴桃黄酮、多糖的提取工艺研究，加快其资源开发利用很有必要。

现阶段，软枣猕猴桃的黄酮、多糖提取主要集中在单指标工艺研究，不能很好地评价其提取工艺优劣，且未系统研究各种提取方法之间的差异。本研究以黑龙江省牡丹江市横道河地区生产、经牡丹江师范学院于爽教授鉴定的软枣猕猴桃（标本现存于牡丹江师范学院标本室）为材料，比较常规提取法、闪式提取法、超声波提取法、酶促-微波提取法等对软枣猕猴桃中总黄酮、多糖的提取效果，并采用含量加权法、正交试验法优化工艺参数，进行体外抗氧化研究，以期为软枣猕猴桃的开发利用提供一定的理论依据。

1材料与方法

11主要试剂

葡萄糖，由上海国药集团生产；浓硫酸，由天津市晶科化工有限公司；三氯甲烷、乙酸乙酯，均由天津大茂化学试剂厂生产；芸香苷标准品，纯度>99%，由贵州迪大生物技术公司生产；乙醇、甲醇、盐酸、苯酚，均由沈阳试剂五厂生产；果胶酶、纤维素酶R-10，由日本Wolsen生产。

12主要仪器

T6紫外可见分光光度计，由北京普析通用仪器公司生产；BT25S电子天平，由德国赛多利斯集团生产；R210旋转蒸发仪，由瑞士Buchi生产；SL-2010N超声波提取器，由江苏省南京顺流设备有限公司生产；MCR-3型实验微波提取器，由广东省广州予华设备有限公司生产；JHBE-50T闪式提取器，由江苏省南京庚辰科学仪器有限公司生产。

13提取总黄酮和多糖的对比试验

131提取溶剂精确称取软枣猕猴桃200 g，分别以三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇及水等作为提取溶剂，料液比1 ∶10（gmL），超声波法提取30～40 min；回收溶剂，浓缩，乙醇沉淀，冷冻干燥即获得多糖。将醇沉后的溶液回收乙醇，浓缩，干燥，测定总黄酮。多糖含量测定以葡萄糖为对照品，采用硫酸-苯酚显色法，采用紫外可见分光光度计测定波长为490 nm的吸光度，计算多糖含量；总黄酮测定以芸香苷为对照品，采用亚硝酸钠-硝酸铝法，采用紫外可见分光光度计测定波长为505 nm的吸光度，测定总黄酮含量。多糖对照品在23～23 μgmL范围内线性关系良好，其回归方程为y=0017 5x+0017 6（r2=0999 3）；芸香苷对照品在0110 3～0661 8 mgmL范围内线性关系良好，其回归方程为y=0581 1x+0014 9（r2=0999 2）。

132提取方法软枣猕猴桃200 g，去杂、-20 ℃冰箱预冻12 h，打浆机破碎，低温烘干，备用；采用浸提法、回流提取法、索氏连续提取法等常规提取法、超声波辅助法、闪式提取法、微波辅助法5-8]等提取方法，略有改动，分别提取软枣猕猴桃多糖和总黄酮，料液比均为1 ∶10 gmL。

浸提法：料液浸泡2 d，浓缩干燥，备用。回流提取法：料液回流时间2～4 h，提取2～3次，合并滤液，浓缩干燥，备用。索氏提取法：料液提取6～12 h，浓缩干燥。超声波辅助法：料液提取时间30～40 min，温度35～40 ℃，功率100 W，频率 20 kHz。微波辅助法：料液提取时间10 min，功率300 W。酶促+微波法：料液中加入05%果胶酶和02%纤维素酶（以软枣猕猴桃计），37 ℃处理2 h；微波辅助法提取 10 min，功率300 W。闪式提取法：料液提取温度30 ℃，时间3 min，pH值为75，转速5 000 rmin。酶促+浸提法：料液中加入05%果胶酶和02%纤维素酶（以软枣猕猴桃计），37 ℃ 处理2 h；料液浸泡2 d，浓缩干燥。酶促+闪式提取法：料液中加入05%果胶酶和02%纤维素酶（以软枣猕猴桃计），37 ℃处理2 h；料液提取温度30 ℃，时间3 min，pH值为75，转速5 000 rmin。酶促+超声波法：料液中加入 05% 果胶酶和02%纤维素酶（以软枣猕猴桃计），37 ℃处理2 h；料液提取时间30～40 min，温度35～40 ℃，功率 100 W，频率20 kHz。重复3次，取平均值。

14软枣猕猴桃总黄酮和多糖提取工艺的优化及其稳定性验证

在前期单因素试验的基础上，以复合酶添加量、微波功率、提取时间、料液比等为试验因子，以总黄酮、多糖提取率为指标，采用L9（34）正交试验（表1）优化其提取工艺。以最佳工艺进行3次重复，以验证其工艺稳定性。

15活性成分的测定

151总黄酮采用亚硝酸钠-硝酸铝法9]测定，即取适量提取浸膏，少量甲醇超声溶解，100 mL容量瓶70%甲醇定容；移取上清05～10 mL，测定总黄酮含量。

152多糖采用5%苯酚-硫酸显色法10]测定，即将提取液回收溶解，浓缩至原体积的110～16；加无水乙醇至60%以上，静置12 h；离心，冷冻干燥；取适量热水超声溶解，100 mL 容量瓶定容，移取上清05～10 mL，测定多糖含量。

16提取物体外抗氧化活性

最佳工艺条件提取总黄酮和多糖，将提取液浓缩，40 ℃干燥，备用。参照文献10]的方法并略有改变，测定提取物对超氧阴离子自由基的清除能力，依据文献11]的方法测定提取物对羟基自由基的清除能力。

2结果与分析

21总黄酮和多糖提取的对比试验

211提取溶剂由表2可见，醇类物质作为提取剂对总黄酮和多糖的提取效果相对较好，提取率相对较高。考虑毒性、成本等因素，本试验采用乙醇 ∶水=6 ∶4作为提取溶剂。

212提取方法由表3可见，传统提取法从提取时间、效率等与超声波法、微波法等存在差异，浸提法总黄酮、多糖的提取率分别为028%、015%，不足微波+酶促法的10%。闪式提取法对软枣猕猴桃总黄酮、多糖有较好的提取效果，具有快速、温度低等优势，具有很好发展潜力；由于软枣猕猴桃果实中的果胶吸附作用和阻碍传质原因，浆果对活性物质的提取往往会产生不利影响，通过酶促作用，可明显提高对黄酮及多糖的提取率。本试验采用酶促+微波法以提取软枣猕猴桃的总黄酮、多糖。

22软枣猕猴桃总黄酮和多糖的提取工艺

221提取工艺优化为更好地评价提取工艺，参考文献12]，以提取率的算数平均值比值为系数，对多糖及总黄酮提取率进行加权处理。经计算，多糖（T）系数为175，总黄酮（F）系数为100，其总指标计算公式为：

总指标=175×T+100×F。

由表4可见，影响提取工艺的因素由高到低为复合酶浓度>提取时间>料液比>提取功率，最佳工艺条件为A3B2C1D3，即复合酶（纤维素酶+果胶酶）浓度05%+04%、料液比1 ∶15 gmL、提取时间10 min、功率在300 W，其加权收率为6754 3%。依据k值，最佳组合A2B2C1D3不在正交设计表范围内，须进一步验证以获得最佳工艺。将A2B2C1D3组合依据试验方法进行提取，获得多糖、总黄酮的提取率分别为1876%、289%，其结果低于组合A3B2C1D3。因此，软枣猕猴桃多糖、总黄酮最佳提取工艺为A3B2C1D3。

222最佳提取工艺稳定性验证试验结果表明，软枣猕猴桃总黄酮、多糖3次提取率分别为3197%、3201%、3190%和1982%、1998%、2011%，平均值分别为3196%、1997%，相对标准差分别为018%、073%，在10%以内，另考虑试验误差，说明本试验最佳提取工艺较为稳定。

23活性成分抗氧化试验

由图1、图2可见，软枣猕猴桃提取物具有良好的羟基自由基、超氧阴离子自由基清除效果，提取物浓度为08 mgmL时其清除率在7000%以上。

3结论

乙醇 ∶水=6 ∶4作为提取剂，对软枣猕猴桃总黄酮、多糖的提取效果相对较好，其提取率分别为189%、134%，虽然甲醇 ∶水的提取效果也较好，但考虑毒性和操作性，所以本试验采用乙醇 ∶水。微波法提取软枣猕猴桃总黄酮、多糖有良好的操作性，通过正交试验优化和加权分析，微波法在软枣猕猴桃总黄酮及多糖提取上具有提取时间短、料液比适中、耗能相对较低的特点，在最佳提取工艺复合酶（纤维素酶+果胶酶）浓度05%+04%、料液比1 g ∶15 mL、提取时间 10 min、功率在300 W条件下，其多糖提取率平均为1997%，总黄酮提取率平均为3196%。软枣猕猴桃提取物在 08 mgmL 以上时，对羟基自由基、超氧自由基的清除率在7000%以上，具有较好的抗氧化活性。最佳提取工艺经试验验证，标准差在10%内，具有较好的稳定性。

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