超声辅助提取剑叶龙血树树叶总黄酮工艺的优化

材料与方法

1.1  材料与试剂

材料：剑叶龙血树树叶采自广西崇左市江州区环城路，去掉剑叶龙血树树叶的两端，洗净晾干后切成小片继续晒干，晒干后粉碎，过20目筛，备用;乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠均为分析纯;芦丁（批号：21911，上海晶纯试剂有限公司）。

1.2  主要仪器

SG2200HPT型超声波洗涤机（河南兄弟仪器设备有限公司）;UV-1601型紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）;AR12XCN型电光分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）。

1.3  方法

1.3.1  提取液制备及分析方法  准确称取0.500 0 g原料，加入一定量不同体积分数的乙醇，超声波提取一定时间，过滤后定容至50 mL，准确吸取1 mL样品溶液至10 mL比色管，首先加入0.4 mL 5%NaNO2溶液，充分摇匀静置6 min后加入0.4 mL 10% Al（NO3）3溶液，充分摇匀静置6 min加入4%NaOH溶液4 mL，80%乙醇溶液定容至刻度，充分摇匀静置15 min，在最佳波长下测定其吸光度。

1.3.2  单因素试验

1）料液比对总黄酮得率的影响。准确称取剑叶龙血树树叶0.500 0 g，60%乙醇溶液作为提取剂，超声波功率60 W，室温下分别以料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（m∶V，g/mL）提取30 min，过滤后定容至50 mL，在499 nm测定其吸光度，计算总黄酮得率。

2）提取剂浓度对总黄酮得率的影响。准确称取5份剑叶龙血树树叶0.500 0 g，分别用30%、40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液进行提取，料液比为1∶25，在室温60 W超声波功率下提取30 min，过滤后定容至50 mL，在499 nm测定其吸光度，计算总黄酮得率。

3）超声波功率对总黄酮得率的影响。准确称取5份剑叶龙血树树叶0.500 0 g，70%的乙醇溶液以1∶25料液比于室温下，分别在40、50、60、70、80、90、100 W的超声波功率下提取30 min，过滤后定容至50 mL，在499 nm测定其吸光度，计算总黄酮得率。

4）提取温度对总黄酮得率的影响。准确称取5份剑叶龙血树树叶0.500 0 g，设置提取温度分别为30、40、50、60、70、80 ℃，70%的乙醇溶液以料液比1∶25在60 W超声波功率下提取30 min，过滤后定容至50 mL，在499 nm测定其吸光度，计算总黄酮得率。

5）提取时间对总黄酮得率的影响。准确称取5份剑叶龙血树树叶0.5000 g，70%乙醇以料液比1∶25在超声波功率60 W、40 ℃下分别提取30、40、50、60、70、80 min，过滤后定容至50 mL，在499 nm测定其吸光度，计算总黄酮得率。

1.3.3  标准曲线的绘制  准确配制0.250 0 mg/mL的标准溶液，按“1.3.1”的分析方法进行显色，在300～600 nm波长之间扫峰，确定最大吸收波长为499 nm。准确吸取芦丁标准品溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL，分别依次置于5支10 mL的比色管中，按照“1.3.1”分析步骤在499 nm处测定吸光度。以吸光度及标准液浓度绘制标准曲线，标准方程为A=10.857C+0.059 4，其中A为样品吸光度，C为溶液浓度，R2=0.999 5，在一定范围内呈良好的线性关系。

1.3.4  稳定性试验  准确吸取样品溶液1 mL于10 mL比色管，加入芦丁标准品溶液1 mL，按“1.3.1”的分析方法在499 nm测定吸光度，每隔6 min测定1次，共测定6次，发现溶液显色后在30 min内变化微小，RSD值为0.23%。

1.3.5  回收率测定  准确吸取5份样品溶液各1 mL于10 mL比色管，分别加入芦丁标准品溶液1 mL，按“1.3.1”的分析方法在499 nm测定吸光度，平均回收率为99.54%，RSD值为0.48%。

1.3.6  总黄酮得率的计算  采用可见分光光度法测定剑叶龙血树树叶的总黄酮，依据标准方程计算提取液中总黄酮的浓度，再按以下公式计算剑叶龙血树树叶总黄酮的得率。

总黄酮得率=■×100%

2  结果与分析

2.1  单因素试验结果

2.1.1  料液比对总黄酮得率的影响  由图1可以看出，剑叶龙血树树叶总黄酮的得率随着料液比的升高先增大后减小，在料液比为1∶25时剑叶龙血树树叶总黄酮的得率达到最大值。故选择料液比1∶20、1∶25、1∶30作为正交试验的料液比水平。

2.1.2  提取剂体积分数对总黄酮得率的影响   由图2可以得出，剑叶龙血树树叶总黄酮的得率随着提取剂乙醇体积分数的增大而升高;当乙醇为70%时，剑叶龙血树树叶总黄酮的得率达到最高，故试验选择60%、70%、80%作为正交试验的提取剂乙醇体积分数的水平。

2.1.3  超声波功率对总黄酮得率的影响  由图3可以得出，剑叶龙血树树叶总黄酮的得率随着超声波功率的升高而增加，在超声波功率为60 W时剑叶龙血树树叶总黄酮的得率达到最大值;超过60 W时，剑叶龙血树树叶总黄酮得率反而降低，这可能是由于超声波功率过强破坏了细胞结构。故选择50、60、70 W作为正交试验的超声波功率水平。

2.1.4  提取温度对总黄酮得率的影响  由图4可看出，剑叶龙血树树叶总黄酮的得率随提取温度的升高而升高，70 ℃时总黄酮得率达到最大值。提取温度升高了40 ℃，总黄酮得率提高不多。

2.1.5  提取时间对总黄酮得率的影响  由图5可知，随着提取时间的增加，剑叶龙血树树叶总黄酮得率先升高后减小，在提取时间70 min时剑叶龙血树树叶总黄酮的得率达到最大值。故试验选择60、70、80 min作为正交试验提取时间的水平。

2.2  正交试验结果

2.2.1  正交试验因素和水平  根据单因素试验可知，提取剂乙醇体积分数（A）、料液比（B）、超声波功率（C）及提取时间（D）四个因素对剑叶龙血树树叶总黄酮的得率影响较大，超声温度对剑叶龙血树树叶总黄酮的得率影响较小。为了更全面考察剑叶龙血树树叶总黄酮提取因素的影响效果，在70 ℃下进行4因素3水平的正交试验，因素和水平如表1所示。

2.2.2  正交试验结果  通过四因素三水平的正交试验，按“1.3.1”分析方法测定提取液总黄酮，计算得率，极差分析及方差分析结果如表2、表3所示。由表2的极差分析可以得出，对剑叶龙血树树叶总黄酮得率的影响的大小次序为A、B、D、C。在考察的影响因素内，改变提取剂乙醇体积分数对剑叶龙血树树叶总黄酮的影响是最大的，其次是料液比、提取时间，最后是超声波功率。

由表3方差分析可知，提取时间、料液比和提取剂体积分数对剑叶龙血树树叶总黄酮的得率具有显著影响，特别是提取时间，但是超声波功率在考察数值范围内对剑叶龙血树树叶总黄酮的得率影响不显著。通过正交试验结果分析和方差分析可以得出，剑叶龙血树树叶总黄酮提取的最佳工艺条件为A2B2C3D1，即70%的乙醇、料液比1∶25、提取时间60 min、超声波功率70 W。在最佳提取工艺条件下重复3次试验，总黄酮的得率分别为1.599%、1.607%、1.608%，说明超声辅助提取剑叶龙血树树叶总黄酮的工艺稳定、可靠。

3  小结

超声波辅助提取剑叶龙血树树叶总黄酮，采用可见分光光度法进行测定，通过5因素的单因素试验和4因素3水平的正交试验，确定剑叶龙血树树叶总黄酮的最佳提取工艺为提取温度70 ℃、提取剂乙醇体积分数70%、料液比1∶25、超声波功率70 W、提取时间60 min，在此提取工艺条件下剑叶龙血树树叶总黄酮的平均得率为1.605%。

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