shRNA敲低ILK后对人脑胶质瘤细胞U251增殖、迁移及侵袭的影响

对照组U251。转染48 h后，以1∶6稀释传代至新6空板中，细胞贴壁后，用提前配置的含有8 μg/ml的嘌呤霉素RPMI-1640培养液持续筛选3周。荧光倒置显微镜下观察，待长出克隆细胞团后，随机挑取10个，继续应用相同筛选压力培养2周，再次挑取克隆细胞团已形成稳定转染细胞株。

1.2.3 检测 逆转录酶-实时荧光定量多聚酶联反应（RT-PCR）检测构建的三种细胞株中ILK mRNA表达水平，按照Trizol试剂说明书，分别提取未转染U251、敲低ILK质粒U251-si、空载体质粒U251-N总RNA，后依照TIANGEN试剂盒说明进行反转录操作，制备相应cDNA。按照Takara说明书操作，实时TR-PCR扩增引物序列为：ILK，上游引物5′-TGAAGACACAAACAGACG-3′与下游引物5′ -TCAAGGATAGGCACAATC-3′；β-actin，上游引物5′-GTTGCCCTGAGGCTCTTTTCCA-3′与下游引物5′-ACCACCAGACAGCACTGTGTTG-3′；E-cadherin上游引物5′-ATGCCGCCATCGCTTACAC-3′与下游引物5′-CGACGTTAGCCTCGTTCTCA-3′；Cyclin D1上游引物5′-ACCTGAGGAGCCCCAACAA -3′与下游引物5′-TCTGCTCCTGGCAGGCC -3′；Snail上游引物：5′-GACCACTATGCCGCGCTCTT-3′，下游引物：5′-TCGCTGTAGTTAGGCTTCCGATT-3′。使用ABI7300 Fast Real-Time PCR系统与SYBR荧光染料进行检测，反应条件为95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s测定相应溶解曲线。mRNA的相对量采用2-ΔΔCt法，测定标准PCR扩增效率。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖能力 分别将U251、U251-si、U251-N分别消化计数后以100 μl，2×103个/孔的密度接种于96孔板中，每种细胞设5个复孔，检测12、24、48、72、96 h细胞增殖活性。每空加入10 μl CCK-8溶液孵育30 min。在450 nm波长下测定吸光度（OD）值，重复3次，绘制细胞各组生长曲线。

1.2.5 细胞迁移及侵袭实验 取U251细胞系及稳定转染后的U251-N、U251-si，分别将细胞密度调整至2×103/ml加至Transwe上室面，同时于下室加入500 μl含20%胎牛血清1640培养基，37 ℃培养24 h后，棉签擦去上室内的细胞 ，Transwell小室底面用0.1%结晶紫染色，正置显微镜进行观察和拍照，随机选取3～5个视野，细胞计数。侵袭实验预先按说明书，于上室面制备基质胶后，再行上述实验。

1.3 统计学处理

应用SPSS 10.0软件进行分析，计量资料采用t检验，多组间均数比较应用方差分析，当P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 稳定转染细胞株的建立及ILK的表达水平的检测

通过阳离子聚合物转染试剂介导的质粒转染方法，建立敲低ILK组U251-si、空载体组U251-N，因质粒中含有Pac基因，转染后的细胞经过2 μg/ml嘌呤霉素的筛选，其筛选浓度是由嘌呤霉素作用1～4 d内杀死所用细胞U251细胞的最低浓度，Pac基因的表达赋予细胞对嘌呤霉素的抗性，缺乏分解嘌呤霉素能力的细胞死亡，从而初步筛选出稳定转染细胞株。当各个独立细胞形成细胞集落后，应用单克隆环圈套，予以消化后传代于新的孔板中，继续予以嘌呤霉素筛选压力，同时质粒携带GFP绿色荧光蛋白基因，转染细胞在筛选压力下表达的绿色荧光蛋白可在倒置荧光显微镜下观察（图1A）。

Western blot结果显示，转染敲低ILK组（17.2±0.9）与转染空质粒组（42.6±1.7）比较，ILK蛋白表达水平降低降低41.3%（P<0.05）（图1B、C）。在mRNA转录水平，U251-si组的ILK表达水平较U251及U251-N组受到明显抑制，其表达水平下降85.7%（P<0.05）（图1D）。

2.2 细胞增殖能力

CCK-8法检测可见，随着时间延长，在48～72 h，U251-si组较U251-N及U251增殖活性明显减低（P<0.05），可见ILK的表达在胶质瘤U251细胞系增殖中有重要作用。进一步实验发现当敲低ILK表达后，U251-si组Cyclin D1蛋白及mRNA表达量较U251及空质粒转染组明显降低（P<0.05）（图2A、B）。

2.3 迁移、侵袭能力检测

通过Transwell实验，U251细胞迁移能力实验，U251-si组（213.6±9.2）个、U251-N（464±9.6）个及U251组（505.6±18.5）个，转染组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）（图2B），细胞侵袭实验中，U251-si组（311.6±8.2）个、U251-N（465.0±13.6）个及U251组（403.0±12.5）个。转染组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），提示敲低ILK表达后能显著抑制U251细胞的迁移、侵袭能力。

2.4 Cyclin D1、E-cadherin、Snail检测

敲低ILK对U251细胞中Cyclin D1、Snail、E-cadherin转录水平影响，分别降低了85.2%、84.6%，提高了71.4%（P<0.05），蛋白表达水平分别降低了60.1%、71.3%、提高56.2%（P<0.05）。证实与U251-N及U251组相比较，敲低ILK表达的U251-si 组Cyclin D1、Snail 表达明显降低、E-cadherin表达量明显升高（图2B、C、D）。

3 讨论

近些年研究发现，ILK在肝癌、肺癌、乳腺癌等人类肿瘤中广泛高表达，且与其恶性程度有相关性[6-7]。由于在胶质细胞瘤中ILK对其有重要意义，目前其产生及作用机制暂不十分明确，为了进一步了解ILK功能，笔者应用shRNA技术在胶质瘤细胞系U251中敲低ILK的表达来研究其影响。敲低ILK表达的稳定转染细胞株其增殖能力明显降低，除此之外，迁移、侵袭能力同样降低。综上所述，ILK可对脑胶质瘤细胞系有重要影响。

本研究中，通过CCK-8方法，发现ILK与胶质瘤U251增殖密切相关。Cyclin D1为多种细胞周期蛋白之一，其为正性细胞周期调控因子，作用于G1期，促使细胞进入S期，与肿瘤增殖密切相关[8]，实验敲低ILK表达的胶质瘤细胞株，Cyclin D1转录及蛋白质水平降低，进而改变细胞周期。提示ILK通过调节Cyclin D1影响细胞增殖。

近期研究发现，在肺癌中，ILK能够降低E-钙粘蛋白的表达，同时提高肿瘤细胞侵袭、迁移能力。通过本实验，关于E-钙粘蛋白得出了类似结论。E-cadherin是一种钙依赖性跨膜糖蛋白粘附分子，介导细胞与细胞间黏附，维持组织结构和功能的稳定，限制细胞运动，其表达下调或不表达是可导致肿瘤细胞的转移和侵袭[9]。

在本研究中，实验结果显示特异性抑制ILK后，E-cadherin的表达在mRNA转录、蛋白水平均显著升高，同时，发现敲低ILK表达的胶质瘤细胞株迁移、侵袭能力明显降低，显示出ILK能够通过特异性细胞信号通路调整E-cadherin蛋白的表达，从而影响肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。然而，通过ILK促进肿瘤细胞转移的具体机制，仍然需要进一步讨论。

Snail为锌指结构转录因子，可与E-cadherin启动子的E-box结合，降低其表达水平，进一步影响肿瘤细胞间粘附能力[10-11]。Vessey等[11]认为E-钙粘蛋白表达降低与癌分化程度之间存在显著相关性。Tan等[12-13]研究认为ILK能激活E-钙粘蛋白的抑制物Snail，使E-钙粘蛋白表达下调，导致细胞间粘连丢失，从而促进肿瘤形成、侵袭和转移。本实验中，抑制ILK后，Snail表达随之降低，与上述结论相似。

研究发现敲低ILK后，U251细胞的增殖、迁移及侵袭能力均显著降低，同时E-钙粘蛋白及snail表达水平。表明ILK可能是抑制胶质瘤增殖、迁移及侵袭的重要肿瘤抑制基因。

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（收稿日期：2014-11-02） （编辑：何玉勤）